8040娱乐威尼斯人

免费咨询电话: 400-699-0631      
 
 
 
公司动态
 





分光光度计 260/280 260/230 比值所代表意义
发表日期:2020/4/21 来源:中科瑞泰(北京)生物科技有限公司   访问次数:次

分光光度计 260/280 260/230 比值所代表意义

核酸在波长 260 nm 处有最高吸收峰。 吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的,所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质,不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法不能区分 DNA RNA,只能用来鉴定核酸的纯度和含量。 蛋白质由于含有芳香氨基酸,因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm 波长处,在 260nm 处的吸收值为核酸的十分之一或更低,故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。 RNA 的 260nm 与 280nm 吸收的比值在 2.0 以上;DNA 的 260nm 与 280nm 吸收的比值则在 1.9 左右。当样品中蛋白质含量较高时260/280的比值即下降。如何避免吸光值漂移读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器, 表现出的吸光值漂移越大。事实上, 分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度。

1.核酸本身物化性质:溶解核酸的缓冲液的 pH 值、离子浓度等在测试时,离子浓度太高也会导致读数漂移,因此建议使用 pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液(如 TE)可大大稳定读数。 核酸的吸光值受 pH 值和缓冲液离子浓度影响。 只有在一定的 pH 值和低离子浓度的条件下(如 10 mM Tris-HCl pH 8.0 ),才能得到精确的检测结果。水的 pH 值不稳定,可能导致检测误差。一些缓冲液在紫外范围内存在自身吸收,为了确保准确测量,请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液。

2.样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素,由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于 0.1A  ,吸光值最好在 0.1-1.5 A 8040娱乐威尼斯人。在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范围)。

3.8040娱乐威尼斯人操作因素:如混合要充分,否则吸光值太低, 甚至出现负值;混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品, 否则浓度差异太大; 换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。

8040娱乐威尼斯人 各波长具体含义及相关问题

1. A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长,最佳测量值的范围为 0.1 1.0。如果不在此范围,稀释或浓缩样品,使之在此范围内;如果吸光度小于 0.05 ,检查是否存在操作因素(如移液不准确,样品内有悬浮物等)影响。DNA 样品的 A260  吸光度值是否 >0.1。(请注意,这个值跟仪器无关,核酸的吸光度必需大于 0.1,其值才有效和可靠,因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收,其值 <0.1 );

2. A280nm是蛋白最高吸收峰的吸收波长, A260/A280比值可进行核酸样品纯度评估: 纯 DNA 的 A260/A280 比值为 1.8, 纯 RNA为 2.0。如果比值低,表示受到蛋白(芳香族)或酚类物质的污染,需要纯化样品。

3. A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯 DNA 和 RNA 的A260/A230 比值为 2.5。若比值小于 2.0 标明样品被碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染,需要纯化样品。 A230 产生负值主要是由于在很低 DNA  浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。 在下一个测定中,需要降低样品的稀释度, A230 的负值会被校正。

4. A320nm A340nm 为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。 该值应该接近 0.0。如果不是,说明溶液中有悬浮物, 需要纯化样品。纯样品的 A320 一般是 0

5. A260/A280 A260/A230 是核酸纯度的指示值。纯度好的 DNA 或 RNA,在 pH7-8.5  下 A260 / A280 的比值应该在 2.0  或 2.5。纯净的样品A260 / A280比值大于 1.8(DNA)或者 2.0(RNA )。如果比值低于 1.8  或者 2.0,表示存在 蛋白质 或者酚类物质的影响。 A230 表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物、盐(胍盐)等,较纯净的核酸 A260/A230的比值大于 2.0  。当 260/230<1 时,只有两种情况。一是胍盐污染,二是蛋白污染。当 0.5BSA 蛋白质污染时,蛋白污染会导致 260 280 的数值都下降,但 260/280 的比值变化并不显著(即是说比值可能也在1.7-1.8)。但蛋白残留会导致 230 的数值显著上升,显著降低 260/230 的比值。也就是说,如果 RNA 样品的 260/280 1.7260 /230 0.58040娱乐威尼斯人,那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留,而是蛋白残留 。

6. 其他:用分光光度计 测量核酸样品 时,应该用有缓冲能力pH8.010mM Tris-HCl 溶解核酸样品,不应该用水,用水稀释核酸样品会造成 A260/A280 比值下降。原因是低离子强度和低 pH 溶液会增加 280 nm 处的光吸收值。


TOP】【打印本页】【关闭窗口



中科瑞泰(北京)生物科技有限公司 版权所有 网站管理   快递查询   IF查询
电话:010-58437227 免费电话:400-699-0631 传真:010-57909566
  内勤订货QQ:2446698252   技术支持QQ:460449375 电子邮箱:real-times@vip.163.com
注意:公司所有产品仅供科研使用
_×
在线咨询
var _hmt = _hmt || []; (function() { var hm = document.createElement("script"); hm.src = "https://hm.baidu.com/hm.js?b00abc75c9fc3bffd64d361752657c7a"; var s = document.getElementsByTagName("script")[0]; s.parentNode.insertBefore(hm, s); })();